缺血性脑血管病是导致人类致残最主要的病因，中枢神经系统损伤后轴突再生及神经网络重组与神经功能恢复关系紧密，因此，缺血性脑卒中后神经再生是目前神经科学研究的热点。养血清脑颗粒是一种现代中药复方制剂，其主要成分为当归、川芎、熟地、细辛等，具有改善软脑膜微循环、增加脑血流量、缓解脑血管痉挛的药理基础，从而起到改善慢性脑缺血，保护神经元的作用。本实验采用大鼠大脑中动脉栓塞模型观察养血清脑颗粒对炎性因子核因子-κBp65（NF-κBp65）、白细胞介素-6（IL-6）、轴突相关蛋白的表达及神经功能恢复的影响，从而探讨其对脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用。
材料与方法
实验动物与药品 清洁级健康成年雄性SD 大鼠250~280 g。养血清脑颗粒（天津天士力制药股份有限公司；国药准字Z10960082）。
大脑中动脉闭塞/再灌注模型的制作 经腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉大鼠后，将其仰卧位固定在手术台上，颈正中切口，逐层分离肌肉和筋膜，暴露右侧颈总动脉、颈内与颈外动脉。烧断颈外动脉的分支甲状腺上动脉及颈内和颈外动脉之间的交通支。夹闭颈总动脉和颈内动脉，用眼科剪在颈外动脉残端做一切口，由此向颈内动脉缓慢插入预先肝素化的线栓（0.23～0.26 mm），插入深度距离颈总动脉分叉处约18 mm时微感阻力即到大脑中动脉起始部， 用丝线结扎线栓并缝合伤口。缺血2 h后轻轻拨出线栓， 待栓头到达动脉分叉处停止，实现再灌注。手术后用恒温毯使其肛温维持在37 ℃。假手术组仅分离右侧颈总动脉、颈内和颈外动脉，不插入线栓。
动物分组及给药 72 只SD大鼠随机分为假手术组（S组）、缺血/再灌注组（I/R组）、生理盐水对照组（I/R+C组）和养血清脑颗粒治疗组（I/R+YXQ组），每组18只。养血清脑颗粒于再灌注的同时进行灌胃给药（2 g/kg），每日1 次。对照组以等量的生理盐水代替药物灌胃。
免疫组化 在术后第2 天及第2 周对各组大鼠进行神经功能评分后，取SD大鼠缺血脑组织制作石蜡切片（片厚4 μm）进行免疫组化检测，采用平均吸光度值作为待测蛋白的相对表达量。
Western blot 检测 在术后第2 天断头取脑，采用蛋白质印迹法（western blot）对NF-κBp65 蛋白表达进行检测，NF-κBp65/β-actin 的比值作为该蛋白表达的相对含量。
行为学评分 将大鼠放入用树脂玻璃制成的透明盒子，盒子内两侧各有7层楼梯，每个楼梯的圆形食槽放置45 mg食物小球，每5 min 添加1次，将大鼠左前肢在1 h内抓取食物小球的个数作为其前肢运动功能的评分。大鼠在脑缺血/再灌注前2周进行左侧前肢的运动功能训练，脑缺血/再灌注后1、2周进行左前肢运动功能的评估。
统计学分析 计量数据用均数±标准差表示方差齐性数据，多组间比较采用单因素方差分析，并采用最小显著差异法（LSD-t检验）进行两两比较。检验水准α=0.05，以P≤0.05表示差异有统计学意义。
结果
大鼠缺血侧皮质IL-6、NF-κBp65 蛋白的表达 免疫组化显示缺血/再灌注后第2天，I/R组缺血侧皮质内IL-6（0.414±0.024）和NF-κBp65（0.706±0.085）的表达同S组（0.208±0.019；0.180±0.014）相比明显增高（P<0.001），主要表达在细胞质和细胞核。I/R+YXQ 组IL-6（0.320±0.023）和NF-κBp65（0.392±0.084）的表达明显低于I/R组（P<0.001）。缺血/再灌注后第2周，I/R组IL-6和NF-κBp65 的水平均显著下降恢复到正常水平，同I/R+YXQ组相比差异不显著（P>0.05）（表）。
大鼠缺血侧皮质轴突再生情况 免疫组化染色显示S组可见大量神经丝蛋白200（NF-200）反应阳性细胞，NF-200 主要位于细胞膜和轴突膜上。I/R组在缺血后第2天时NF-200 反应阳性细胞显著减少，阳性纤维结构紊乱，长度缩短。缺血后第2 周，I/R组缺血侧皮质神经元NF-200阳性细胞有所增加，结构仍较紊乱。IR+YXQ组在缺血后第2周时NF-200蛋白表达相对值为（0.166±0.014），较I/R组（0.139±0.010）有所增加，排列较规则，差异显著（P=0.003），但在手术后第2 天时其表达同I/R组表达无明显差异（P>0.05）（图）。
大鼠缺血侧皮质神经元核抽提物中NF-κBp65 蛋白的含量 Western blot 检测结果显示，I/R组（1.078±0.206）和I/R+C组（0.923±0.053）在缺血/再灌注后第2天NF-κBp65 蛋白表达均显著高于S组（0.152±0.062）（P<0.001），与I/R组相比，I/R+YXQ组NF-κBp65蛋白（0.553±0.085）的增加明显受到抑制（P<0.001）。缺血/再灌注后第2 周，I/R组和I/R+C组NF-κBp65 蛋白均恢复到S组水平（P>0.05）。
行为学评分 造模前各组大鼠楼梯测试左前肢运动功能无明显差异（P>0.05），同S 组（69.33±1.37）比较，I/R组（21.33±1.63）和I/R+YXQ组（22.67±1.63）在缺血/再灌注后第2 周时左前肢抓取能力明显降低（P<0.001），但两组之间无显著差异（P=0.178）。
■ 讨论
脑卒中是我国第一大致死及成人致残性疾病。缺血性脑卒中患者的康复是目前研究的热点，中枢神经的再生是神经康复的关键所在，通过促进缺血性脑损伤后神经元轴突的生长，增强其与周围脑组织重新建立神经网络有助于神经功能的恢复。NF-200是神经元特有的结构蛋白，在促进轴突再生、维持轴浆运输及细胞间信号传递方面起到重要作用。因此本实验用NF-200 的免疫染色评价神经元轴突的形态及轴突生长。
目前已证实，养血清脑颗粒具有抗氧化、缓解血管痉挛、增加脑血流量等药理作用。熊（Xiong ）等研究表明养血清脑颗粒具有抗氧化、增强胆碱乙酰转移酶的活性及抑制海马神经元的凋亡等作用，从而促进慢性脑缺血大鼠认知功能改善。养血清脑颗粒的神经保护作用同时与维持神经元突触结构完整性有关。本研究发现，养血清脑颗粒能抑制脑缺血/再灌注损伤急性期的炎症反应，缺血/再灌注后第2周时，可提高缺血侧皮质NF-200 蛋白的表达，使大鼠的神经功能评分增加。
综上所述，养血清脑颗粒对大鼠脑缺血/再灌注损伤具有神经保护作用，其机制可能与抑制脑缺血急性期炎性因子的活化，上调缺血侧皮质轴突蛋白的表达，促进大鼠神经功能的恢复有关。（该文已发表于《重庆医科大学学报》2013年第38卷第6期）
（重庆医科大学附属第一医院神经内科 重庆市神经病学重点实验室 陶涛 秦新月 徐广会）
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